qPCR实验方法及检测报告模板（qpcr实验步骤详细）

一、检测服务信息

1、检测方法：SYBR Green染料法

2、分析方法：相对定量

二、实验主要材料

1、主要仪器

2、主要试剂

三、实验操作

1、总RNA抽提

1）样品前处理

组织样本：取约100 mg样品至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转移至装有1 mL RNAiso Plus的1.5mL离心管中，振荡混匀后室温静置约5min。

2）相分离

每1mL RNAiso Plus加入0.2mL氯仿，振荡混匀15s后室温静置约3min，4℃，12000rpm，离心15min。

3）沉淀

转移水相至新的1.5mL离心管中，每1mL RNAiso Plus加入0.5mL异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃，12000rpm，离心10min。

4）洗涤

弃上清，每加入1mL75%的乙醇，混匀后4℃，7500rpm，离心5min。

5）溶解

弃上清，空气干燥RNA沉淀约5min（注意不要完全干燥，只需沉淀泛白即可），加入适量的DEPC处理水溶解RNA沉淀。

6）测定浓度和纯度

用分光光度计测定RNA浓度和纯度后记录数据。

2、反转录反应

1）按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。

2）按如下程序进行反转录：

37℃,15min；85℃，5sec。

-20℃保存备用！

3、定量PCR检测

1）将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2）冰上配制下表中的反应液

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

四、相对定量△△Ct分析原理和方法

1、荧光信号理论方程

Rn = RB X0 (1 E)n Rs

第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度RS)与分子数目的乘积。

或总信号=本底信号 分子数量´单位信号强度

其中，Rn为第n个循环时的总信号，RB为本底信号，RS为单位信号强度，X0为起始模板数量，E为PCR效率。

2、公式推算

当循环次数n=Ct值时，假设E=100%时：

RCt=RB X0×2CtRs

X0×2Ct=(RCt-RB)/Rs=b

X0=b/2Ct=b×2-Ct

3、内参基因均一化样本差异

每个样品都检测目的基因和内参基因，用内参基因做均一化处理，校正各样品在核酸数量上的差异，校正值=目的基因/内参基因，即X1/X2=2-(Ct1-Ct2) =2 -△ Ct

2 -△ Ct即表示为每个样品中目的基因经过均一化处理后的分子数量。

4、处理样品和对照样品比较

比较不同样品间某个基因的表达量差异，相对值=处理样品/对照样品

即倍数变化为2 -△ Ct1/2 -△ Ct2 = 2 – △ △ Ct

五、实验结果

实验原始数据见文件夹“原始数据”；引物信息、上机排版及检测结果详见提供的Excel表格“检测结果”。

检测结果

六、项目内容

公众号：如期生物

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